NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

          L-α-phosphatidylcholine từ lòng đỏ trứng (PC trứng, ~60%) và rutin được nhập từ Sigma (Mỹ). Các dung môi như ethanol và chloroform đã được sử dụng loại siêu tinh khiết. Việc bào chế các ethosome yêu cầu sử dụng thiết bị cất quay (BUCHI, Thụy Sĩ) và thiết bị siêu âm đầu dò (BRANSON, Hoa Kỳ). Kích thước ethosome được đo bằng ELS-Z (Otsuka, Nhật Bản).

           Thấm thuốc qua da: Nghiên cứu đã sử dụng bộ tế bào khuếch tán Franz (Permegear, USA) bao gồm tế bào khuếch tán Franz 9 mm (thể tích thụ thể 5 mL) và mẫu V6A máy khuấy. Tính toán hiệu quả tải ethosome và sự thâm nhập rutin qua da được thực hiện bằng cách sử dụng HPLC (chất lỏng hiệu suất cao sắc ký, Shimadzu, Nhật Bản).

2. Chuẩn bị ethosome

          Ethosome được điều chế theo phương pháp hydrat hóa màng mỏng phương pháp [19-22]. PC trứng (2%, w/v) và rutin (0,005-0,05%, w/v) được hòa tan trong chloroform trong bình cầu đáy tròn 50 mL. Hỗn hợp được làm bay hơi trong thiết bị cất quay và vết dung môi đã được loại bỏ. Màng được ngậm nước bằng dung dịch ethanol (20% ethanol, v/v) ở trên nhiệt độ chuyển hóa lipid trong 1 giờ. Các ethosome được phân tán bằng cách sử dụng máy siêu âm đầu dò sau 30 phút.

4. Đo kích thước ethosome

         Kích thước ethosome trong huyền phù và đặc tính liposome được đo bằng dụng cụ ELS-Z. Các hạt lơ lửng trong chất lỏng là chuyển động Brown do va chạm ngẫu nhiên với các phân tử dung môi. Hệ số khuếch tán tỷ lệ nghịch với kích thước ethosome theo phương trình Stokes-Einstein. Thông qua hoạt động tán xạ ánh sáng, sự dao động về cường độ của ánh sáng tán xạ từ các ethosome trong chuyển động Brown có thể được đo. Vận chuyển trong chuyển động Brown là chuyển động ngẫu nhiên, cường độ phân tán dao động là ngẫu nhiên. Dao động của ánh sáng tán xạ là được phân tích bằng cách sử dụng hàm tự tương quan. Phương thức CONTIN đã được sử dụng để giải quyết các phân phối kích thước túi từ các chức năng tự tương quan đo được. Phương thức CONTIN tính đến trọng số của phân phối do sử dụng các điểm dữ liệu rời rạc trong phân phối liên tục và sau đó tính toán các khoảnh khắc khác nhau của phân phối được tính toán.

5. Đo lường hiệu suất nạp thuốc

         Rutin không hòa tan được loại bỏ khỏi 1 mL thể tích của hỗn dịch ethosome và liposome bằng bộ lọc 1,2 µm (Minisart; CA, 26mm). Các ethosome sau đó được phân hủy bằng 15 mL ethanol và ethanol được làm bay hơi trong thiết bị cô quay. Các rutin sau đó được hydrat hóa lại trong 1 mL ethanol. Để định lượng rutin tự do trong dung dịch ethanol hoặc trong nước cất, lấy mẫu ethosome và liposome chứa một lượng rutin được hòa tan trong dung dịch ethanol hoặc trong nước cất, phần rutin không hòa tan đã được loại bỏ bằng cách lọc qua màng 1,2µm. Các mẫu sau đó được đo bằng HPLC ở 355 nm của bước sóng hấp thụ cực đại thông thường.

Phương trình (1) sau đây đã được sử dụng để tính toán hiệu quả nạp ethosome.

                         Hiệu suất nạp (%)={(CP−CE)/C0}×100 (1)

Trong đó, CP là rutin đi qua màng lọc 1,2 µm, CE là rutin tự do trong dung dịch ethanol 20% và C0 là lượng rutin ban đầu được thêm.

Phương trình (2) được sử dụng để tính toán hiệu quả nạp tại liposome:

                        Hiệu suất tải (%)={(CP−CD)/C0}×100 (2)

Trong đó, CP là rutin đi qua màng lọc 1,2 µm, CD là rutin tự do trong nước cất, và C0 là rutin ban đầu được thêm.

6. Đo độ đàn hồi

          Độ đàn hồi của màng túi được xác định bằng cách đùn, sử dụng máy đùn mini như đã mô tả trước đây [23-25]. Các ethosome và liposome được ép đùn qua màng polycarbonate có kích thước xác định (80nm) bằng cách áp dụng một áp suất 0,2 MPa trong một phút. Kích thước màng túi được theo dõi trước và sau khi lọc bằng ELS-Z. Độ đàn hồi của màng túi được biểu thị bằng công thức sau:

                                              E=Jflux×(rv/rp)²                     

         Trong đó, E là độ đàn hồi của màng túi, Jflux là lượng hỗn dịch đã đi qua màng, rv là kích thước màng túi (sau khi ép đùn) và rp là kích thước của lỗ màng.

7. Nghiên cứu thấm thuốc qua da trong ống nghiệm

         Các nghiên cứu về sự thấm thuốc qua da đã được sử dụng để xác định tác động của việc tăng cường sự thấm thuốc qua da của rutin trong hệ thống phân phối ethosomal. Chuột ICR trắng lai (8 tuần tuổi, cái) đã được sử dụng. Da chuột, bao gồm biểu bì và hạ bì, được lấy từ bề mặt lưng. Các thí nghiệm đã được chạy trong các tế bào khuếch tán Franz với một thụ thể thể tích ngăn 5 mL. Các thụ thể ngăn chứa một giai đoạn thụ thể (HCO-60 : ethanol : nước muối đệm phosphat  (PBS) =2 : 20 : 78 [w/w/w%]), và da được cố định giữa ngăn cho và giai đoạn thụ thể của lớp sừng hướng lên trên vào ngăn cho. Nhiệt độ được duy trì ở 37±1°C. Các mẫu được áp dụng cho da trong ngăn cho. Các mẫu được rút qua cổng lấy mẫu của tế bào khuếch tán ở 2, 4, 8, 12 và 24 giờ. Giai đoạn thụ thể ngay lập tức được bổ sung với một thể tích tương đương của giai đoạn thụ thể mới. Quy trình trong các mẫu đã rút được phân tích bằng HPLC ở bước sóng 355 nm. Lượng rutin giữ lại trong da được xác định vào cuối thí nghiệm thấm thuốc qua da trong ống nghiệm (24 giờ). Da đã được rửa sạch ba lần với PBS. Phần da còn lại được phân tích lượng rutin trong lớp sừng bằng cách bóc màng [26,27]. Sauk hi bóc màng, da được cắt thành những phần nhỏ bằng kéo. Màng và da được thêm vào 10 mL ethanol. Dung dịch được bay hơi trong thiết bị cô quay sử dụng pha thụ thể ngậm nước. Hàm lượng  rutin sau đó được phân tích bằng HPLC ở bước sóng 355 nm.

8. Định lượng HPLC

         Lượng rutin được xác định bằng phương pháp định lượng HPLC sử dụng 2% axit axetic trong nước : 0,5% axit axetic trong 50% axetonitril (90 : 10- 40 : 60, gradient [v/v%]) làm pha động và được phân phối ở tốc độ dòng 1 mL/phút. 20 µL tiêm được rửa giải trong C18 cột (4.6×250 mm, Shim-pack VP-ODS, Shimadzu) tại phòng nhiệt độ. Dung dịch rửa giải cột được theo dõi ở bước sóng 355 nm sử dụng. Máy dò mảng diode SPD-M20A (Shimadzu). Các đỉnh rutin được phân tách với thời gian lưu là 16 phút.

9. Phân tích thống kê

        Tất cả dữ liệu được báo cáo được trình bày dưới dạng trung bình ± S.E.M. Ý nghĩa thống kê được xác định bởi kiểm định t- test

Người viết bài: Ths. Trịnh Thị Loan

Người duyệt bài: Ths. Nguyễn Thị Thùy Trang

Nguồn báo:

https://link.springer.com/article/10.1007/s11814-013-0232-3