Nhận xét: ở câu 1 của bài này để sử tính % tạp liên quan người ta sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích.

PP1: Chuẩn hóa diện tích.

Trong cách tiếp cận này hàm lượng của một tạp chất liên quan riêng lẻ được tính theo phương trình sau:

% tạp chất  = × 100%

Diện tích tạp chất là diện tích của peak tương ứng với chất đó và tổng diện tích là tổng diện tích của hoạt chất và tất cả các tạp chất (không tính diện tích pic chất không lưu giữ). Đây là một trong những cách đơn giản nhất để định lượng tạp chất vì không cần chất chuẩn đối chiếu.

Tuy nhiên trong trường hợp mẫu phân tích chứa những tạp nó hàm lượng rất thấp thì rất có thể khi tiến hành sắc ký tại nồng độ phân tích trên sắc ký đồ sẽ không xuất píc của các tạp chất có hàm lượng thấp (do diện tích píc tạp nằm dưới khoảng phát hiện) khi đó dẫn đến việc mất một số píc tạp à kết quả định lượng tạp sẽ thấp hơn kết quả thực (mắc sai số -).

• Để khắc phục nhược điểm này sẽ phải tăng nồng độ mẫu phân tích nhưng khi tăng nồng độ mẫu đến một ngưỡng nào đó sẽ xảy ra hiện tượng bão hòa Detector với pic hoạt chất. (hiện tượng này giống như hiện tượng bão hòa cơ chất với enzyme: khi nồng độ cơ chất đã đủ lớn để liên kết hết với trung tâm hoạt động của enzyme khi đó có tăng nồng độ cơ chất lên nữa thì tốc độ phản ứng cũng không tăng) hay nói một cách khác khi Detector đã bão hòa thì dù nồng độ chất phân tích có tăng lên thì diện tích pic cũng không tăng lên nữa tức diện tích pic thu được trên sắc ký đồ sẽ thấp hơn diện tích pic thực có thể đạt được. Điều này dẫn đến việc nếu sử dụng sắc ký đồ của mẫu phân tích có nồng độ cao để tính %tạp sẽ gây ra sai số +.

Để khắc phục nhược điểm này của phương pháp chúng ta có phương pháp “pha loãng”

PP2: Phương Pháp Pha Loãng

Trong kỹ thuật này, mẫu phân tích được chuẩn bị ở cả hai mức nồng độ cao và nồng độ thấp. Chúng đều được tiến hành chạy sắc ký trong cùng điều kiện để thu lấy sắc ký đồ.

Sắc ký đồ mẫu trước pha loãng (pic hoạt chất bị tù à đã bão hòa Detector)

Sắc ký đồ mẫu sau pha loãng

Mục đích tiêm các mẫu có nồng độ cao, nhằm phát hiện tất cả các tạp kể cả tạp chất có nồng độ thấp do nồng độ mẫu phân tích cao à tăng diện tích pic tạp à các tạp có hàm lượng nhỏ cũng vẫn được phát hiện à tăng độ nhạy của phương pháp.

Mẫu ở nồng độ thấp được pha loãng từ mẫu có nồng độ cao: hệ số pha loãng sẽ phụ thuộc vào ngưỡng giới hạn tạp quy định: ví dụ khi đặt giới hạn tạp là 1% thì ta pha loãng 100 lần; còn nếu đặt giới hạn tạp là 0,5% thì pha loãng 200 lần

Việc tiêm mẫu có nồng độ thấp để đảm bảo sự đáp ứng của pic hoạt chất với detector vẫn tuyến tính (tránh hiện tượng bão hòa detector). Khi đó diện tích pic của hoạt chất ở mẫu sau pha loãng sẽ phản ánh đúng giới hạn của diện tích píc của tạp chất. Mặt khác phương pháp chuẩn hóa diện tích dựa trên giả thiết: Sự đáp ứng của các chất với Detector là như nhau). Vì vậy lúc này ta chỉ việc so sánh diện tích pic tạp ở sắc ký đồ trước pha loãng với diện tích của hoạt chất ở sắc ký đồ của mẫu sau pha loãng.

Nếu Stap (trước pha loãng) > S(hoạt chất) sau pha loãng => kết luận: không đạt

Hạn chế của phương pháp này là tổng thời gian phân tích sẽ tăng lên gấp đôi và có thể mắc phải sai số do pha loãng.